Netosis: desarrollo de bioensayos costo-efectivos para screening y caracterización de compuestos inductores y antagonistas

Abstract

En búsqueda de alternativas costo-efectivas para el desarrollo de micrométodos de screening multiwell para el monitoreo de NETosis, se analizaron varios intercalantes de DNA. A partir de preparaciones comerciales de Methyl Green-Pyronin Y se encontró que el segundo componente posee propiedades espectroscópicas compatibles con los objetivos buscados. Trabajando con cromatografía analítica se desarrolló un sencillo método de purificación mediante extracción sólido-líquido en acetona. El compuesto purificado, disuelto en DMSO y diluido en PBS presenta una coloración rosada, es biocompatible, fotoestable y sólo es internalizado en células no viables o fijadas químicamente. Este sistema exhibe una absorción máxima a 548nm por lo que es excitable por líneas 514nm y 561nm, con un pico de emisión de 571nm. Experimentos de 2,5hs de incubación de leucocitos polimorfonucleares humanos con Glucosa Oxidasa confirmaron la utilidad de Pyronin Y en la detección de figuras NETóticas. Ensayos de microscopía de superresolución indican que el compuesto permite detectar las alteraciones en los núcleos multilobulados de PMN que constituyen los pasos iniciales de entrada en NETosis.  Microscopias de tiempo de vida media de fluorescencia (FLIM) en dominio temporal demuestran la utilidad del compuesto para diferenciar entre NETs vertidas al medio extracelular y el material genético constituyente del núcleo.